JS NewsPlus - шаблон joomla Продвижение

TEKNIK MOLEKULER UNTUK DETEKSI DINI KEMURNIAAN VARIETAS DAN PENYAKIT PADA TANAMAN BUAH TROPIKA

 

Oleh: Riry Prihatini, S.Si, M.Sc

Penggunaan benih yang berkualitas merupakan salah faktor penentu keberhasilan dalam bidang pertanian. Benih berkualitas tidak hanya harus berasal dari pohon induk yang bersertifikasi, sehingga karakter benih sesuai dengan varietas yang diinginkan, namun juga harus sehat, yaitu terbebas dari segala penyakit.

Benih murni atau benih true to type adalah benih  yang memiliki sifat yang sesuai dengan karakteristik pohon induk. Penggunaan benih yang tidak murni dapat menyebabkan kualitas dan kuantitas produksi yang tidak sesuai dengan yang ditargetkan. Dengan demikian, pengujian kemurnian varietas patut dilakukan demi menjaga keberlanjutan dan kualitas produksi. Karena sulitnya menentukan kemurniaan varietas berdasarkan data morfologi terutama saat tanaman masih pada tahap vegetatif, maka pengujian kemurniaan varietas dapat dilakukan dengan menelusuri susunan genom tanaman, salah satunya adalah dengan metode RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphisme DNA- Polimerase Chain Reaction). PCR adalah teknik molekuler yang digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) fragmen DNA. Data fragmen DNA tersebut selanjutnya dapat dianalisis untuk menentukan kemurnian varietas tanaman. Selain itu, Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) kini juga telah banyak diaplikasikan untuk mendeteksi penyakit pada tanaman.

Gambar 1. Prosedur umum pelaksanaan PCR: DNA diekstraksi dari sampel tanaman, ekstrak DNA dicampur dengan taq master mix dan primer, campuran DNA dimasukkan ke dalam mesin PCR, hasil PCR dicek dengan elektroforesis, gel hasil elekroforesis dianalisa.

Metode lain yang dapat digunakan untuk menguji keberadaan virus pada benih tanaman adalah metode ELISA (Enzyme Linked Immunosobent Assays). ELISA adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mengukur konsentrasi analit (biasanya berupa antibodi atau antigen) pada suatu larutan. Salah satu teknik ELISA yang umum digunakan adalah ELISA sandwich, yaitu teknik dengan penggunaan dua macam antibodi (penangkap dan pelacak) yang mengapit antigen (sehingga dianalogikan seperti roti lapis).

Gambar 2. Metode ELISA sandwich: (a) antibodi melekat pada fase padat; (b) setelah inkubasi dan pencucian 1, antigen ditambahkan; (c) setelah inkubasi dan pencucian 2, antibodi ditambahkan (d) setelah inkubasi dan pencucian 3, substrat enzim ditambahkan sehingga terjadi perubahan warna.

Karena sampel yang digunakan untuk pengujian pada kedua teknik tersebut – ELISA dan PCR— umumnya adalah daun atau batang tanaman, maka pengujian dapat dilakukan pada saat umur tanaman masih muda (baik yang menunjukkan gejala penyakit atau pun tidak). Dengan demikian pengujian dapat dilakukan sedini mungkin tanpa harus menunggu tanaman berproduksi dan dapat mencegah kerugian yang lebih besar.

Pengujian Kemurnian Varietas
Kemurnian suatu varietas menandakan kesamaan sifat antara tanaman yang diuji dengan deskripsi varietas . Hal ini dapat ditelaah, salah satunya dengan metode RAPD. Metode RAPD dapat digunakan untuk membandingkan susunan genom suatu tanaman dengan tanaman yang lain. Sampel tanaman yang true to type akan menunjukkan pola pita DNA yang sama dengan sampel varietas dari tanaman induk, sebaliknya sampel tanaman off type akan menghasilkan pola pita DNA yang berbeda.

Secara teknis, metode RAPD dilakukan dengan memperbanyak sampel DNA dengan menggunakan beberapa buah primer di dalam mesin PCR. Primer akan melekat secara random pada pita DNA dan memperbanyak segmen tersebut. Proses selanjutnya adalah proses elektroforesis yang diikuti dengan pewarnaan, serta visualisasi DNA dibawah sinar ultraviolet (UV).  Susunan pita DNA hasil RAPD suatu sampel dapat dibandingkan dengan sampel lain untuk melihat kesamaan genetik sampel yang diuji.

Gambar 3. Contoh hasil PCR pada uji kemurnian varietas dengan teknik RAPD menggunakan primer P5; baris 1 adalah sampel pohon induk, baris 2-4 adalah anakan; baris 1dan 2 menunjukkan pola pita yang sama, sedangkan baris 3 dan 4 menunjukkan pola berbeda dengan baris 1 dan 2, artinya sampel anakan pada baris 2 adalah true to type, sedangkan sampel anakan baris 3 dan 4 off type.

Pengujian Penyakit CVPD Pada Tanaman Jeruk
CVPD (Citrus vein phloem degeneration) atau yang lebih dikenal dengan nama penyakit huanglongbing adalah penyakit pada tanaman jeruk yang disebabkan oleh bakteri Liberobacter asiaticus. Tanaman jeruk yang terserang CVPD memperlihatkan gejala belang-belang kuning tidak merata pada daun tua. Pada gelaja lebih lanjut, daun yang terbentuk menjadi lebih kecil dan lebih kaku. Penyakit ini dapat menyebabkan kerugian besar karena dapat menyebabkan kematian tanaman jeruk. Namun demikian, gejala CVPD sulit diamati karena sifatnya yang mirip dengan gejala kekurangan hara (unsur Zn).

Di alam, penyakit ini disebarkan oleh vektor serangga Diaphorina citri, yang juga dapat menjadi hama tanaman jeruk. Selain itu, penyakit ini dapat pula menular melalui bibit tanaman yang diperbanyak melalui grafting atau mata tempel.  Karena penyebab utama penyakit CVPD adalah bakteri, maka pengujian penyakit ini dapat dilakukan dengan mendeteksi keberadaan bakteri L. asiaticus dalam sampel tanaman.

Pada aplikasi PCR untuk mendeteksi penyakit tanaman, maka fragmen DNA yang diperbanyak adalah fragment DNA khusus yang berasal dari agen penyebab penyakit (bakteri). Karena struktur DNA tanaman dan bakteri berbeda, maka dapat dirancang primer (elemen pada PCR) yang hanya akan memperbanyak fragmen bakteri. Jika hasil PCR menunjukkan adanya pita DNA yang berkorelasi dengan pita DNA bakteri, maka sampel tanaman dapat dikatakan tercemar penyakit.

Lebih lanjut, keberadaan bakteri tersebut dapat dideteksi dengan teknik PCR (Polymerase chain reaction), yaitu sebuah teknik perbanyakan DNA. Dengan menggunakan sepasang primer O11 dan O12c, gen 16S yang khas ada dalam bakteri, keberadaan agen penyebab penyakit CVPD ini dapat diketahui. Jika sampel yang diuji menunjukkan adanya band (pita) yang berukuran 1160 bp, maka dapat ditarik kesimpulan sampel tanaman terserang CVPD.

Gambar 4. Contoh hasil PCR deteksi CVPD pada tanaman jeruk dengan metode PCR; S2, S4, dan S5 menunjukkan sampel positif terkena CVPD.

Pengujian Penyakit Bunchy Top pada Tanaman Pisang
Bunchy top adalah salah satu penyakit virus yang banyak ditemukan pada tanaman pisang, ditularkan oleh aphid Pentalonia nigronervosa. Penyebab penyakit bunchy top adalah  BBTV (Banana Bunchy Top Virus), yaitu virus dengan DNA rantai tunggal dari genus Nanovirus, family Circoviridae. Virus ini menyerang pembuluh floem tumbuhan, sehingga daun yang terbentuk lebih sempit dari pada daun normal, berwarna kuning, dan datar. Pohon yang terserang BBTV terlihat cebol bersemak pada bagian atas pohon, dan sebagian besar gagal untuk memproduksi buah. Virus BBTV menyebar dari pohon ke pohon, biasanya penyebab invansi penyakit ini pada area baru adalah penggunaan materi tanaman yang terkontaminasi materi virus BBTV.  Karena jumlah kerugian yang disebabkan penyakit ini sangat besar, maka deteksi BBTV secara dini sangat diperlukan.

Deteksi BBTV dapat dilakukan salah satunya dengan metode ELISA. Pada pemanfaatan ELISA untuk deteksi BBTV, virus penyebab BBTV berperan sebagai antigen. Antigen tersebut dapat dikenali oleh antibodi spesifik, yaitu antibodi khusus BBTV. Pada aplikasi teknik ELISA sandwich, setelah dilapisi dengan antibodi penangkap spesifik, ekstrak sampel tamaman pisang dimasukkan ke dalam sumuran lempeng ELISA. Setelah 2 jam inkubasi pada suhu ruang, lempeng dicuci dan selanjutnya ditambahkan dengan antibodi pelacak spesifik. Langkah berikutnya adalah pewarnaan menggunakan p-nitro penil posfat. Perubahan warna menjadi berwarna kuning yang akan terjadi jika ekstrak tanaman mengandung virus BBTV dapat diamati secara kuantitatif dengan spektrofotometer. Jika nilai densitas optik hasil spektrofotometer sampel dua kali lebih besar dari nilai kontrol negatif, maka sampel dinyatakan positif mengandung virus BBTV.

 

Pengujian Penyakit CTV pada Tanaman Jeruk
Citrus Tristeza Virus atau CTV adalah virus dengan rantai tunggal RNA yang berasal dari kelompok Closteroviruses. Virus ini menyerang hampir semua tanaman pada genus Citrus dan  muncul hampir di semua area pertanaman jeruk di seluruh dunia. Gejala penyakit ini beragam, namun secara umum tanaman yang terserang rebah, batang rusak, dan tanaman menguning.

Pada pendeteksian penyakit ini dengan metode ELISA sandwich, virus penyebab CTV berperan sebagai antigen yang akan dapat dikenali oleh antibodi spesifik (antibodi penangkap dan pelacak) CTV. Dengan pewarnaan menggunakan p-nitro penil posfat, bila sampel mengandung virus CTV, maka sumuran ELISA akan memperlihatkan warna kuning, atau dapat dikuantifikasi dengan spektrofotometer.

Gambar 5. Contoh pelaksanaan pengujian BBTV dan CTV dengan metode ELISA, warna kuning menunjukkan sampel positif mengandung materi virus.

27 Februari 2015